研究背景

免疫檢查點阻斷(ICB)療法通過阻斷腫瘤細胞的免疫逃逸機制，重新激活患者體內(nèi)的免疫反應(yīng)來對抗癌癥。為了有效殺傷腫瘤，CD8 T 細胞可識別由人類白細胞抗原 I 類（HLA-I）分子呈遞的腫瘤特異性抗原肽。在人類中，有三個主要的 HLA-I 基因（HLA-A、HLA-B 和 HLA-C）。然而，ICB療法的響應(yīng)率并不一致，且存在治療抵抗性問題。為了提高ICB療法的預測準確性和治療效果，研究人員開始探索影響ICB反應(yīng)的多種因素，包括腫瘤免疫表型、體細胞基因組特征和腸道微生物組等。HLA-I基因型因其在調(diào)控免疫應(yīng)答中的核心地位而備受關(guān)注。來自紀念斯隆凱特琳癌癥中心的Timothy A. Chan團隊提出了一個關(guān)鍵問題：HLA-I基因型是否會影響T細胞對腫瘤抗原的識別能力，進而影響患者對免疫檢查點抑制劑的治療反應(yīng)? 為了回答這一關(guān)鍵問題，Chan團隊設(shè)計了一項全面的研究。

研究方法

1. 樣本數(shù)據(jù)：本研究使用了接受ICB治療的兩組癌癥患者數(shù)據(jù)。隊列1包含369名接受免疫檢查點抑制劑治療的患者(269例晚期黑色素瘤，100例晚期非小細胞肺癌)的外顯子組測序和臨床數(shù)據(jù)；隊列2包含1166名來自紀念斯隆-凱特琳癌癥中心的不同類型癌癥患者的靶向Panel測序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。

2. HLA I類基因分型：本研究通過高準確性工具Polysolver直接分析正常生殖細胞的外顯子組測序數(shù)據(jù)，或者使用經(jīng)過臨床驗證的HLA分型檢測方法（如LabCorp的檢測服務(wù)）來執(zhí)行高分辨率的HLA I類基因分型。此外，對于隊列1，使用HLA-SOAP進行了HLA II類基因分型。

3. 統(tǒng)計分析：使用Kaplan-Meier estimator進行生存分析，采用log-rank檢驗統(tǒng)計顯著性，使用單變量或多變量Cox回歸計算風險比?；谌怙@子測序的非同義突變總數(shù)計算腫瘤突變負荷，并使用R函數(shù)test設(shè)定截斷值，將患者分為高低兩組。采用wilcoxon-秩和檢驗比較HLA純合子組和雜合子組間的體細胞突變數(shù)以及治療中TCR CDR3克隆性。

4. 突變分析：對于隊列1，分析按DePristo等人描述的方法進行。FASTQ格式的配對末端讀段使用Burrows-Wheeler比對器與參考人類基因組GRCh37進行比對，利用GATK進行局部重新比對，使用Picard去除重復讀段。使用整合了四種突變調(diào)用器的pipeline（MuTect、Strelka、SomaticSniper和Varscan）識別體細胞單核苷酸變異（SNVs）。等位基因讀數(shù)少于4或相應(yīng)正常覆蓋度少于7個讀段的SNVs被過濾掉。使用由三個調(diào)用器（Strelka、VarScan和Platypu）組成的pipeline識別小插入和缺失（indels）。對于隊列2，相對突變負荷使用MSK-IMPACT確定。

5. HLA I類基因雜合性喪失分析：使用FACETS進行拷貝數(shù)變異分析，以確定等位基因特異性拷貝數(shù)。識別包含HLA-A、HLA-B和HLA-C位點的染色體6p位點內(nèi)的片段。使用expectation-maximization model，將任何HLA位點的次要等位基因拷貝數(shù)估計為0定義為雜合性喪失（LOH）。

6. TCR β鏈測序和分析：研究對治療中（Nivolumab啟動后4周）收集的腫瘤樣本子集進行了測序（TCR-seq）。隨后計算了TCR CDR3譜系的clonality，定義為均勻度的補數(shù)（即1-均勻度）。均勻度定義為觀察到的Shannon熵（H）除以給定群體中唯一元素數(shù)量的最大可能H（4）。從Adaptive Biotechnologies獲得了單個TCR序列的數(shù)據(jù)，包括V和J基因段識別和CDR3序列，用于T細胞譜系的自定義分析。對每個觀察到的VJ組合，單獨分析了由單個VJ盒組合編碼的CDR3氨基酸序列的克隆性。

7. HLA I類結(jié)構(gòu)分析和分子動力學模擬：使用VMD Mutator插件突變PDB 1M6O中pHLA復合物中的新抗原結(jié)構(gòu)，以符合所需的B44基序（F3I、P4G、A6V、F9Y）。所有圖像均使用VMD軟件包進行渲染。分離的HLAI類等位基因和HLA肽復合物的分子動力學（MD）模擬來自最高可用分辨率的晶體結(jié)構(gòu)：HLA-B*15:01（PDBID:1XR9)；HLA-B*07:02（PDBID:5EO0)；和HLA-B*53:01（PDBID:1A1M)；所有的MD模擬都使用NAMD軟件包進行模擬。使用GROMACS 軟件套件中包含的標準工具計算殘差間分離和殘差位置均方根波動（RMSFs）。

研究結(jié)果

1. HLA-I雜合性顯著提高ICB治療患者的生存率： 本研究通過對1535名接受ICB治療的癌癥患者的HLA-I基因型進行分析，發(fā)現(xiàn)與至少有一個HLA位點為純合子的患者相比，HLA-I位點的最大雜合度（“A”、“B”和“C”）提高了ICB治療后的總生存率（圖1A-C）。HLA-I純合性與低突變負荷強烈相關(guān)，與雜合性高突變負荷的患者相比，生存率降低（圖1D-G）。HLA-I基因的雜合性喪失（LOH）的患者生存率降低，且對腫瘤突變負荷低的患者生存率影響更大。此外，HLA雜合子患者表現(xiàn)出更高的TCR CDR3克隆性（圖3F，G）。

圖1.  HLA-I純合性對ICB治療患者生存率的影響。(A，B) 隊列1/2中至少一個HLA-I位點的純合性與OS降低相關(guān)；(C)所有1535例患者的HLA-I純合性與OS降低相關(guān)；(D，E)在兩個隊列中分別比較了具有雜合HLA-I位點且高突變負荷的患者與具有純合HLA-I位點且低突變負荷的患者的生存率，發(fā)現(xiàn)雜合性且高突變負荷的患者生存率更好；(F，G)HLA-I雜合性和突變負荷對生存率的聯(lián)合影響比單獨的突變負荷更大；(H)HLA-I的LOH與ICB治療患者的OS降低相關(guān)；(I)低突變負荷腫瘤中的LOH相對高突變負荷和無LOH腫瘤對預后影響更大。

2. HLA-B44超型對總生存率的影響：在兩個獨立的黑色素瘤隊列中，將HLA-I等位基因分類為12個不同的超型（圖2A，B）， 發(fā)現(xiàn)HLA-B44超型患者對延長生存期效果顯著（圖2C，D），尤其是在考慮體細胞突變負荷時（圖2E-H）。

圖2.  HLA-B44超型對ICB治療的黑色素瘤患者生存的影響。(A，B)隊列1/2中黑色素瘤患者中不同HLA超型的患病率；(C，D)對隊列1/2中攜帶B44等位基因（B44(+)）與不攜帶B44等位基因（B44(-)）的患者的生存情況；(E，F(xiàn))對隊列1/2中攜帶B44等位基因且具有高突變負荷的患者與不攜帶B44等位基因且具有低突變負荷的患者的生存情況；(G，H)B44等位基因和突變負荷對生存率的聯(lián)合影響比單獨考慮突變負荷更大；(I)TCGA隊列中B44等位基因與生存率無顯著關(guān)聯(lián)；(J)B44等位基因中常見的肽基序與已知的免疫原性新抗原相關(guān)聯(lián)。

3. HLA-B62超型與不良預后相關(guān)：B62超型與生存率的負相關(guān)性主要由HLA-B*15:01等位基因驅(qū)動（圖3A）。通過三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其在肽結(jié)合槽中具有獨特的結(jié)構(gòu)橋（圖3B，C）。分子動力學（MD）模擬顯示，與其他HLA-B等位基因相比，HLA-B*15:01在結(jié)合肽段時保持了結(jié)構(gòu)橋的完整性，并且橋接殘基變得更不靈活，這可能影響T細胞受體對新表位的有效識別（圖3D，E）。

圖3.  HLA-B*15:01等位基因?qū)CB治療患者生存率的影響。(A) HLA-B*15:01等位基因的患者生存率降低；(B) HLA-B*15:01、結(jié)合肽和橋接殘基的肽結(jié)合槽三維結(jié)構(gòu)；(C) 在結(jié)合肽殘基位置P2和P3上的橋接隔離效應(yīng)的側(cè)視圖；(D、E) 分離的HLA B*15:01分子及其與UBCH6肽的復合物的MD模擬快照，肽存在時橋接殘基的RMSFs增加；(F、G)治療期間，HLA雜合患者的TCR CDR3克隆性更高。

結(jié)論

通過對1535名接受ICB治療的癌癥患者的HLA-I基因型分析，HLA-I位點雜合性提高了ICB后的總生存期，且HLA-B44超型患者生存期延長，而 HLA-B62超型（包括HLA-B*15:01）或HLA-I時體細胞雜合性缺失與不良預后相關(guān)。HLA-B*15:01的分子動力學模擬揭示了可能損害CD8 T細胞對新抗原識別的不同元素。本研究結(jié)果對于預測對ICB的反應(yīng)和基于新抗原的治療性疫苗的設(shè)計具有重要意義?？偟膩碚f，這項研究為理解HLA-I基因型在癌癥免疫治療中的作用提供了新的視角，并為未來的癌癥治療策略提供了重要的指導。隨著免疫治療的不斷發(fā)展，深入理解這些遺傳因素如何影響治療效果，將有助于實現(xiàn)更個性化、更有效的癌癥治療。

參考文獻

Diego Chowell et al. ,Patient HLA class I genotype influences cancer response to checkpoint blockade immunotherapy. Science359,582-587(2018).DOI:10.1126/ science.aao4572

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